反相色譜是目前在高效液相色譜中被廣泛應(yīng)用的技術(shù)，主要原因是它適用于大多數(shù)非極性物質(zhì)以及許多可離子化和離子化合物的分析。

如果某色譜柱出現(xiàn)污染問(wèn)題，通常是因?yàn)樵谶M(jìn)行重復(fù)進(jìn)樣時(shí)，強(qiáng)保留物質(zhì)逐漸累積導(dǎo)致的。簡(jiǎn)單的清洗步驟通常足以清除這些污染物，以恢復(fù)其色譜性能。在進(jìn)行等度運(yùn)行后，如果使用90～100%含量的溶劑B（比如甲醇、乙醚和四氫呋喃等雙溶劑反相系統(tǒng)中洗脫能力較強(qiáng)的溶劑）沖洗20個(gè)柱體積，即可清除污染物。需要注意的是，色譜柱的柱體積和空柱管體積是不同的概念，例如一根4.6x250mm的柱子的柱體積只有2.5ml，而2.1x150mm的柱子則只有0.28ml的柱體積。

若采用緩沖鹽系統(tǒng)，請(qǐng)勿直接切換至強(qiáng)溶劑，因?yàn)橥蝗磺袚Q至高濃度有機(jī)溶劑可能會(huì)導(dǎo)致緩沖鹽在HPLC流動(dòng)體系中沉淀，進(jìn)而引起更嚴(yán)重的問(wèn)題，如柱頭篩板堵塞、連接管路堵塞、泵泄漏、活塞損傷或進(jìn)樣閥轉(zhuǎn)軸失靈。建議先使用無(wú)緩沖鹽流動(dòng)相(即用水代替緩沖液)，沖洗5 ~ 10個(gè)柱體積，然后再切換至強(qiáng)溶劑清洗。

某些情況下，即便使用強(qiáng)溶劑B，也難以清除附著在色譜柱上的污染物。此時(shí)就需要運(yùn)用更為強(qiáng)力的溶劑，或采用一系列溶劑的組合。

如果污染物不是生物質(zhì)的，一種強(qiáng)效溶劑或者幾種溶劑組合的清洗方法基本可以解決問(wèn)題。許多柱子生產(chǎn)廠家的官網(wǎng)和產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)上也會(huì)提供清洗方法的推薦。

所有清洗方法的步驟通常相似，使用的溶劑強(qiáng)度會(huì)逐漸增加，最后一個(gè)溶劑通常會(huì)是非極性非常強(qiáng)的，例如醋酸乙酯或者烷烴，以便溶解非極性污染物如脂質(zhì)和油類。每個(gè)溶劑在系列中都要確保與下一個(gè)溶劑互相溶解。

在完成整個(gè)清洗過(guò)程后，必須采用一種中等強(qiáng)度、互溶性非常好的溶劑來(lái)過(guò)渡回到原來(lái)的流動(dòng)相體系。例如，我們可以選用異丙醇作為過(guò)渡溶劑，因?yàn)樗饶芘c正己烷或二氯甲烷互溶，也能與水相溶劑互溶。然而，由于異丙醇的粘度很高，我們需要保持較低的流速，以避免造成泵壓過(guò)高的情況。